Prévision de la taille des allèles amplifiés

du marqueur TH01

La prévision de la taille des amplicons est une étape préalable à toute amplification par PCR. Il s'agit ici de prévoir la taille des fragments d'ADN des principaux allèles du marqueur TH01, quand l'amplification est réalisée avec le système PowerPlex 16 ( Promega) avec les amorces suivantes:
- gauche 5'GTGATTCCCATTGGCCTGTTC3'
- droite 5'CCTCCTGTGGGCTGAAAAGCTC3'
Ensuite, il faut comparer les tailles théoriques ainsi déterminées avec celles qui sont réellement mesurées sur un électrophorégramme (pics des allèles de référence).

Rappel : le locus TH01 (11p15.5) est un microsatellite STR (TCAT)n dont les principaux variants chez l'homme sont les allèles 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9.3, 10, 11 et 13.3. Il est situé dans le premier intron du gène qui code la Thyrosine Hydroxylase.
A voir, autres données .

Prévision de la taille des allèles amplifiés de TH01
Les élèves doivent d'abord rechercher une séquence qui contient le marqueur STR TH01 (Genbank) puis utiliser des outils (Primer Blast ou Primer3)qui permettent de positionner les amorces et de déterminer la longueur du fragment amplifié.

Cas de l'allèle 9 : (TCAT)9 , avec Primer3
Cas de l'allèle 6 : (TCAT)7 avec Primer-Blast
Taille prévue pour chacun des amplicons correspondant aux allèles les plus courants de TH01 (avec le sytème d'amorces choisi)
allèle (TCAT)n
3
4
5
6
7
8
9
9.3
10
11
13.3
taille en pb
152
156
160
164
168
172
176
179
180
184
195

Comparaison taille prévue / taille mesurée sur l'électrophorégramme
L'électrophorégramme permet de mesurer la taille attribuée aux amplicons correspondant aux différents allèles de référence du marqueur TH01, dans le cas d'une analyse donnée. Les valeurs mesurées sont proches des valeurs prévues avec de petites variations.
En réalité, ce qui est pris en compte lors de la détermination d'un génotype, ce n'est pas, en soi, la taille affichée qui peut varier (peu) suivant les conditions expérimentales mais le positionnement des pics correspondant d'une part aux différents allèles de référence nommés à l'aide du nombre de motifs répétés et d'autre part à l'échantillon étudié. Ces positions sont directement dépendantes de l'étalonnage réalisé avec un seul et même marqueur interne standart de taille pour "l'allelic ladder" et pour les échantillons à analyser.